【技术】OPRD刊文︱共固定化多酶体系级联合成D型非天然氨基酸(R)-2-氨基-3-(2-溴苯基)丙酸_新浪财经

转自：凯莱英Asymchem

近日，凯莱英医药集团（股票代码：002821.SZ/6821.HK，以下简称“凯莱英”）在美国化学会学术期刊《Org. Process Res. Dev.》上刊发论文《共固定化多酶体系级联合成(R)-2-氨基-3-(2-溴苯基)丙酸的模型反应》（Co-immobilized multi-enzyme system for the cascade synthesis of (R)-2-amino-3-(2-bromophenyl) propanoic acidionic acid – A model reaction）。

(R)-2-氨基-3-(2-溴苯基)丙酸属于D型非天然氨基酸，D型非天然氨基酸广泛应用于制药、农业、食品和化妆品行业，且多种D -氨基酸已用于生产氨苄西林和阿莫西林、那格列奈、他达拉非、氟戊酸盐等药品，其合成方法通常采用化学法，但化学合成存在路线步骤多、收率低、合成速度慢，产物分离困难等缺点。

凯莱英工程酶团队开发了通过D -氨基酸氨基转移酶（DAAT）催化合成一系列D-氨基酸的合成工艺。但单独使用DAAT催化合成D-氨基酸，转化率只有60%左右，研究人员优化工艺，通过DAAT与乳酸脱氢酶（LDH）和甲酸脱氢酶（FDH）联用技术，形成去除产物抑制的辅酶循环系统（图1），使得转化率提高至99%以上。该三酶联用催化工艺可实现一锅法一步完成D –氨基酸的合成，相比化学法合成工艺，具有合成步骤少、反应条件温和、收率高、绿色环保等优势。

图1. 三酶级联协作合成D -氨基酸

尽管酶催化有诸多独特优势，但游离酶作为催化剂使用的时候仍存在一些局限性，比如：游离酶稳定性低、与产物的分离过程繁琐、再利用困难，且存在蛋白质浸出到最终产品的风险。酶固定化通常有助于解决这些问题，通过酶的固定化可提高效率，降低生产成本，提高恶劣条件下酶的稳定性，允许重复使用，并使产物更容易从反应混合物中分离。

D -氨基酸 (R)-2-氨基-3-(2-溴苯基)丙酸是合成多巴胺 D1 受体 (human dopamine D1 receptor) 正向变构调节剂 (D1 PAM)的重要原料。凯莱英酶固定化团队以该产品为模型，开发固定化酶催化合成D -氨基酸的工艺。在本研究中，三种酶，即来自蜡样芽孢杆菌的D -氨基酸氨基转移酶(bcDAAT)，来自海尔维乳杆菌的D -乳酸脱氢酶(lhD-LDH)和来自念珠菌的甲酸脱氢酶(cbFDH)，通过多酶级联协作反应可高效合成目标产物（图2）。

图2. 三酶级联协作合成(R)-2-氨基-3-(2-溴苯基)丙酸的路线

本研究首先对三个酶分别进行固定化方法筛选和优化，DAAT和D-LDH用氨基型树脂固定化，活性和稳定性最佳，重复使用10次活性无明显降低。但FDH固定化后，活力损失大，且重复使用活性下降明显。通过对酶的稳定性考察，发现FDH热稳定性差，造成固定化酶活性和稳定性差。

三个酶分别固定化后联用，酶固定化操作批次多，导致能耗和人工成本增加，为提高固定化的经济性，本研究对三个酶进行了共固定化开发。DAAT和LDH共同固定化至氨基型树脂，活性高且可重复使用10次。但由于cbFDH很不稳定，三酶共固定化后整体催化性能下降（图3），使用第二次，酶活急剧降低。

图3. DAAT与LDH共固定化酶重复使用稳定性和DAAT、LDH、FDH共固定化酶重复使用稳定性。

为了提高三酶共固定化后的活性和稳定性，研究人员开发了层序固定化策略。首先将DAAT和LDH共同直接固定化至氨基型树脂上，接着通过离子吸附、共价结合等作用使阳离子高分子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）包裹在固定化酶上，最后将FDH经PEI的离子吸附作用结合，形成三酶共固定化酶（图4）。结果表明，cbFDH与其他两种酶先后分层共固定化形成三酶共固定化酶，三种酶均表现出良好的活性和稳定性；重复使用10次（150 h）后，仍有90%的活性（图5）。采用上述固定化多酶在50 g规模上进行批次反应，得到产品(R)-2-氨基-3-(2-溴苯基)丙酸，HPLC纯度99.99%，ee值 99%。

图4. 层序固定化多个酶，实现酶活和稳定性的提升

图5. 共固定化酶重复使用稳定性

此项研究还采用了凯莱英自主开发的连续反应的绿色制药技术。连续反应是将传统的批次生产工艺转变为自动化连续性工艺，有利于实现工艺放大与稳定可持续生产，助推医药精细化工领域的规模化应用。相比传统反应，连续反应技术具有安全性高、自动化程度高、产能大幅提升、减少污染、降低成本等诸多优势，为此被FDA定义为当前制药行业现代化进程中最重要的工具之一，推荐全球制药公司升级工艺采用连续反应的领先技术。凯莱英的研发团队在该固定化酶合成(R)-2-氨基-3-(2-溴苯基)丙酸的工艺中也应用了连续反应技术，在PBR连续流合成中对该工艺进行了评估，结果表明生产效率极大提升，时空产率（STY）达 323.3 g L-1 d-1，相比传统批次反应的STY（31.68 g L-1 d-1 ），产能提升了10倍。

凯莱英研发团队将生物酶催化替代传统路线合成、利用共固定化酶突破游离酶生产瓶颈，最终创造性地与连续反应完美结合，每一步的升级改造都是技术人员智慧的结晶，生动诠释了技术人员勇攀高峰、孜孜不倦、追求卓越的探索精神，正是这种工匠精神支撑凯莱英不断打破传统技术壁垒，一步步发展壮大，成为全球制药产业的重要合作伙伴，持续创造更大的经济效益和社会价值！