RACE专题 | 掌握这些tips，RACE实验顺风又顺水！

转自：诺唯赞生物

RACE(rapid amplification of cDNA end)是研究新基因、解码未知序列的重要方式！

诺唯赞推出RACE技术全攻略专题干货，帮助大家吃透原理、玩转实验！

本期为RACE专题第二期——操作细节篇

RACE实验技术路线

如何设计特异性引物？

引物设计的特异性对于做RACE是至关重要的，5'/3' GSP（基因特异性引物）设计需要注意哪些点？

①　引物长度：23 - 28个核苷酸，建议不超过30个核苷酸；

②　GC含量：50 % - 70 %；

③　Tm值：Tm ≥ 65℃，Tm > 70℃使用Touch Down PCR有助于提高产物特异性；

④　较长（> 10 kb）或丰度较低的待测转录本：GSP引物设计尽量靠近cDNA的末端（≤ 3 kb）；

⑤　针对同一待测转录本可设计多条GSP，进行RACE扩增以提高成功率。

如何合成高质量cDNA？

①　体系配置好后，在72℃条件下孵育3 min后立即置于冰上，这是为了打开RNA的二级结构同时避免RACE中使用的引物较长出现相互交联的情况。

②　cDNA产物稀释：可根据目的转录本丰度高低及首次实验结果进行后续稀释倍数调整；在不清楚基因表达量高低或基因表达量很低时可以不稀释（可根据PCR或qPCR检测基因丰度）。

扩增程序怎么选？

①　需要根据GSP的Tm值选择PCR程序，若GSP引物的Tm值> 70℃，使用降落PCR（Touch Down PCR）有助于提高产物特异性。

②　降落PCR：根据引物的Tm值设置一系列的退火温度，随着循环的进行，退火温度逐渐降低，使得特异目标产物进行优势扩增，兼顾目标产物的特异性和高产量。

巢式PCR怎么做？

  掌握原理    

巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两对引物扩增特异性的DNA片段。第一对引物为GSP。第二对引物为NGSP（NGSP结合在上一轮PCR产物的内部，进行PCR扩增），使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。同时提高扩增倍数，降低了非特异性反应连续放大进行的可能性，并可以鉴定第一阶段反应是否正确。

  明确适用情况   

①　上一轮PCR没有理想的特异产物（如无扩增产物、产物较弱、产物弥散），或者产物非特异条带过多、基因表达丰度低；

②　巢氏PCR与RACE结合可以提高克隆的准确度（RACE产物进行巢式PCR时，其固定接头巢式引物为Nested Primer）；

③　可设计多轮巢式引物进行巢式PCR扩增。

NGSP(巢式基因特异性引物)设计原则

①　引物长度、GC含量、Tm值：同GSP（基因特异性引物）设计原则；

②　位置：NGSP须设计在GSP的3'端，建议NGSP的5'末端与GSP的3'末端有5 - 15 nt的重叠，有助于提高二轮巢式扩增时的特异性。

高回收率的产物纯化怎么做？

通过目的DNA片段切胶回收的方式进行产物纯化，推荐使用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit (Vazyme #DC301)或其他等效产品。产物长度在200 bp - 3 kb之间，不建议目的片段长度< 200 bp，可能会导致胶回收效率低。

高阳性率的克隆实验怎么做？

克隆：推荐用Ultra-Universal TOPO Cloning Kit (Vazyme #C603)或其他等效产品，如果目的扩增产物条带较弱，建议进行多管PCR扩增富集产物纯化后进行克隆，有助于提高克隆阳性率。

转化：转化推荐使用Fast-T1 Competent Cell (Vazyme #C505)或其他等效产品。

阳性克隆鉴定：菌落/菌液PCR鉴定推荐使用2 × Taq Master Mix(Dye Plus) (Vazyme #P112)或其他等效产品。

测序分析：选取经鉴定的阳性单克隆进行一代测序鉴定，测序引物可选择载体通用引物或自行设计引物(推荐至少挑取8 - 10单克隆进行测序)。

RACE试剂怎么选？

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