3D培养系统，助力揭示人类胚胎发育畸形和孕早期流产病因

转自：中国科技网

科技日报记者 赵汉斌

记者5月12日凌晨从昆明理工大学了解到，该校灵长类转化医学研究院及省部共建非人灵长类生物医学国家重点实验室，与中国人民解放军总医院、美国得克萨斯州西南医学中心研究人员合作，开发了一种3D培养系统，实现了食蟹猴胚胎体外25天的长时程培养。

利用该系统，研究人员解析了原肠运动及造血等早期组织器官发生的谱系特化轨迹和分子演进规律，并系统研究了非人灵长类从原肠胚形成，到早期器官发生过程的重要细胞组成及谱系分化轨迹，这将有助于了解人类胚胎发育畸形及孕早期流产的病因。最新一期国际顶级期刊《细胞》发表相关研究成果。

体外培养食蟹猴胚胎双光子三维重构

体外培养食蟹猴胚胎双光子三维重构示意图

胚胎发育异常严重影响人口质量

人的生命起源于早期胚胎，但人类胚胎着床后发育是怎样进行的？原肠前人胚胎和多能干细胞的发育过程究竟是怎样的？胚胎发育畸形及孕早期流产病因是什么？科学家们一直在为这些生命难题找寻答案。

“近年来我国育龄夫妇的流产及出生缺陷发生率已分别接近10%及5.6%，严重影响出生人口质量。”中国科学院院士、昆明理工大学灵长类转化医学研究院院长季维智教授介绍，因生殖健康形势严峻，降低流产及出生缺陷发生率，已成为我国人口健康大战略重要目标之一。

人类如能科学解析胚胎发育的详尽过程及其调控机制，将有助于人们深入理解早期胚胎和器官发育以及疾病发生的关系，为孕早期流产和出生缺陷防治，以及发育源性疾病的诊治提供理论基础和新的途径，这也是当前生殖医学领域亟待解决的难点与热点问题之一。

人胚胎发育的第三周和第四周，要经历几个“里程碑”式的进程。“但人们对这一时期人胚胎发育知之甚少，处于‘黑匣子’状态，对早期胚胎发育调控机制的深入理解，亟待创新性研究体系的建立与理论和技术突破。”论文共同第一作者、昆明理工大学灵长类转化医学研究院讲师白冰说。

食蟹猴是一种与人类遗传与进化较为接近的模式动物。此前，科研人员借助深耕多年建立的非人灵长类动物胚胎体外培养系统，将食蟹猴囊胚体外培养至原肠运动出现，进一步培养至受精后20天，并对原肠运动等多个胚胎发育重要事件进行系统解析，发现多种灵长类动物早期胚胎特有的细胞类型和基因表达特征。

2019年12月，昆明理工大学灵长类转化医学研究院的李天晴教授和季维智院士等与云南省第一人民医院合作，首次建立人胚胎三维培养系统，揭示了原肠前人胚胎和多能干细胞的发育过程。2021年4月，该研究院谭韬教授、牛昱宇教授等人，又首次绘制了人原肠前胚胎的发育全景图，为研究人着床后的早期胚胎发育建立了重要的研究基础。

研究示意图

3D培养系统，解析早期组织器官发生轨迹

为进一步打开人胚胎发育的“黑匣子”，研究团队基于此前的一系列研究，开发和优化了前期食蟹猴胚胎培养系统。

他们借助细胞外基质，构建了食蟹猴胚胎的3D培养环境，借助葡萄糖，促进了胚胎的体外发育，实现了食蟹猴胚胎体外25天的长时程培养。“有了这个平台，我们能够描绘食蟹猴的神经诱导、侧板中胚层分化、卵黄囊造血、原始肠道和原始生殖细胞样细胞发育的谱系轨迹和遗传程序。”谭韬说，而且在这个环境中培养的胚胎形态、发育进程等，与体内胚胎高度一致。

结合单细胞转录组和免疫荧光染色验证，研究人员发现3D培养系统培养的胚胎除了早期神经分化，还出现了造血谱系特化，其高度模拟了体内卵黄囊的两个波次造血发生，尤其是捕获并识别了猴第一波次造血的关键前体细胞，包括生血成血管细胞、第一波次造血祖细胞。这是迄今为止国际学术界首次精确识别和系统解析发生在非人灵长类胚胎中的体内卵黄囊的两个波次造血。

与以往的人多能干细胞体外分化体系相比，体外培养的猴胚胎能够产生更接近人体内第二波次造血的生血内皮细胞，这些结果表明该体系有望成为更合适的灵长类早期造血的研究模型。

随后，研究团队还通过对人、猴、鼠跨物种的整合分析，发现猴的第二波次造血与人更为接近，表明人、猴在早期造血发育中具有较强的保守性，与啮齿类存在差异。“同时，我们还进一步聚焦猴第一波次造血特化的过程，系统揭示了猴和小鼠在该过程中的物种保守和差异的分子事件。”共同通讯作者、昆明理工大学灵长类转化医学研究院陈永昌教授说。

省部共建非人灵长类生物医学国家重点实验室、昆明理工大学灵长类转化医学研究院年轻的研究团队成员。

除了外胚层和中胚层的谱系特化外，研究团队观察到内胚层的特化，在体外培养猴胚胎中发现了早期肠的形成, 其与体内猴胚胎及人胚胎肠亚群高度一致。经过进一步研究，他们发现BMP和EGF信号通路与前肠形成有关，而WNT和Hedgehog信号通路可能在后肠发育中发挥重要作用，因此提出内脏内胚层细胞参与了前、后肠发育过程。

研究表明，体外培养猴胚胎可以形成原始生殖细胞样细胞，原始生殖细胞样细胞是否可以在体外发生迁移并进一步成熟，目前尚不了解。

“随着培养的进行，原始生殖细胞样细胞开始向卵黄囊迁移，随之代谢模式从糖酵解向氧化磷酸化转变，系统揭示了食蟹猴早期胚胎发育中的X染色体剂量补偿调控过程。”白冰说，值得一提的是，研究还揭示，雌性原始生殖细胞样细胞中X染色体总体基因表达水平逐渐上调，且存在X染色体再激活过程。参与X染色体失活的长链非编码RNA，在雄性早期原始生殖细胞样细胞中很少或没有表达，晚期升高，而在雌性原始生殖细胞样细胞中表达水平相对稳定。

“利用这一培养系统，我们成功地延长了灵长类动物胚胎的体外培养，直到早期器官发生，为外食蟹猴体外胚胎发育，提供了一个易于接近、易于处理的平台，可以深入解析灵长类动物原肠胚胎形成阶段以外的关键发育事件。”谭韬说，通过深入研究非人类灵长类动物早期组织器官发生的谱系特化轨迹和分子演进规律，将为了解人类胚胎发育畸形及孕早期流产的病因提供重要的理论基础。

（图片由昆明理工大学提供）

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