ddPCR在优化CAR-T细胞疗法质量控制中的应用|CAR-T_新浪财经

转自：药时空

CAR-T细胞于2017年首次正式进入美国临床，作为一种最有效的个体化癌症治疗方式之一，这种治疗模式具有巨大的潜力。CAR T细胞疗法的革命性影响在于它能够重新调整我们自身的免疫防御系统来杀灭癌细胞：它实质上修改了患者天然存在的免疫细胞，增强了它们对癌细胞的识别和攻击能力，使患者自身的免疫系统能够与疾病作斗争。

尽管CAR - T细胞疗法具有令人难以置信的前景，但CAR - T细胞的生产面临独特的挑战，因为这些细胞不能作为典型的药物治疗。它们是具有独特生物学特性的活细胞，不完全受我们控制，因此被称为“活药物”。因此，CAR T细胞的制造过程需要额外的监督和严格控制，以确保细胞的安全和有效。

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最大限度降低对患者的伤害风险

CAR T细胞制造的精细过程始于从患者血液中提取T细胞。CAR基因通过病毒载体、转座子系统或直接mRNA转导传递给这些细胞。最终产生的CAR蛋白在细胞表面得到表达。最后，CAR T细胞在生物反应器中扩增（繁殖），然后准备回输到患者体内。

目前，全球已经批准上市了9种CAR T细胞疗法，如下表所示：

当然还有许多CAR-T疗法正在进行临床评估。根据ClinicalTrials.gov注册信息，目前有超1000项活跃或招募中的CAR-T细胞疗法临床试验，如下图所示。而根据一项预测，到2028年，全球CAR T细胞疗法市场的估值可能达到80亿美元。

图 CAR-T注册临床全球地图（来源：ClinicalTrials.gov）

质量控制

由于T细胞是活体的，CAR T细胞制造商依赖生物过程来构建它们。因此，开发者必须执行几个质量控制（QC）步骤，以确保这些细胞疗法的功能和安全性。

首先，在转染过程中，CAR基因将随机整合到T细胞基因组的不同位置。这个过程必须密切监测。如果转基因整合到基因组的非编码区域，它将永远不会表达。该基因还可能干扰癌基因并促进肿瘤生长。

此外，制造商无法精确控制每个T细胞中的转基因拷贝数，这也会影响细胞功能。美国食品药品监督管理局（FDA）建议，对于使用逆转录病毒或慢病毒载体的细胞疗法，每个基因组中应复制少于五个转基因拷贝，以减轻由插入性诱变引起的临床风险。较高的拷贝数可能导致CAR T细胞对患者产生毒性作用。在足够高的数量下，CAR蛋白可以引发全身性炎症反应（CRS），这可能导致器官损伤和死亡。因此，为了确保患者的安全和药物的疗效，监测CAR基因的拷贝数以及转基因整合到患者T细胞中的位置对于CAR-T细胞制造商至关重要。

分析方法

科学家通常使用定量聚合酶链式反应（qPCR）来计算CAR基因整合。然而，qPCR只能产生相对的定量结果，需要一个标准曲线进行比较。为了制作标准曲线，生物制造商需要对标准样品进行连续稀释，这是一个耗时、复杂的过程，往往成为实验差异性的根源。此外，qPCR不能检测每个细胞中单个拷贝的整合；它的灵敏度限制在每个细胞至少有两个或三个拷贝。

而另一种更灵敏的定量CAR基因拷贝数的方法是Droplet Digital PCR（微滴式数字PCR，ddPCR）分析。qPCR和ddPCR的原理相似，均使用标准试剂、引物和探针。然而，qPCR每管只能执行一个PCR反应，而ddPCR技术涉及将样本分成数万纳米升大小的液滴，每一个液滴中都独立进行PCR扩增。如果液滴中包含目标序列（CAR转基因），那么它将被扩增，荧光探针将发出可检测的信号。是否可被检测的结果将被收集起来，最终比qPCR提供更精确的定量结果。通过计算含有转基因的液滴百分比，科学家可以确定样品中该基因的浓度，并从中得出T细胞基因组中该基因的平均拷贝数。

主要优势：

1. 无需标准品（标准曲线），对靶标分子实现绝对定量；

2. 可以实现0.01%或以上的突变检出率，更高的灵敏度；

3. 有效区分浓度差异（变化）微小的样品，更高的精密度和重复性；

4. 不依赖扩增效率，能克服PCR抑制剂的影响，特别适合基质复杂样本的检测；

5. 操作过程和结果分析简单。

微基生物ddPCR技术流程：

Case Study

一项在美国国立卫生研究院（NIH）进行的研究证明，ddPCR可有效追踪和定量转染的T细胞中的CAR基因序列。在使用慢病毒或逆转录病毒载体进行转染，培养1-3周后，用流式细胞术测量转染效率，并用ddPCR定量每个基因组中的转基因拷贝数。该方法在实验室内和实验室间的可变性很小。数据表明，在CAR T细胞制造过程中，ddPCR可以作为一种可靠的工具，监测不同实验室、技术人员和时间点的临床CAR-T产品中的转基因拷贝数。这种方法作为流式细胞术的补充，能够定量拷贝数，并帮助阐明其与感染率和转染效率之间的关系。

其他质控应用

ddPCR不仅用于CAR-T细胞制造和安全性测试的上述领域，还可用于监测经过基因工程改造的细胞的持久性和活性，解决对细胞安全性的担忧。

例如，FDA担忧CAR-T细胞的复制可能导致患者体内形成快速进展的T细胞肿瘤。为确保安全，FDA建议科学家测试临床批次、细胞产品及CAR T治疗患者的血液。ddPCR可检测CAR-T细胞中的复制病毒，筛选受感染细胞，并检测其他微生物污染来源。

ddPCR还可用于检测CAR-T细胞在患者治疗后的持久性。这些细胞应在人体内存活数月。若存活时间不足，疗效有限；若持续过久，可能产生不良副作用。病理学家可利用ddPCR定期监测血液中的CAR-T细胞计数，跟踪细胞的持久性。

总的来说，ddPCR可以协助确保T细胞含有正确数量的CAR基因拷贝，从而使治疗安全有效。未来ddPCR将可能进入更多的临床实验室，帮助改善CAR-T细胞治疗的多个方面，并帮助其在未来的个性化癌症治疗中提供更准确和有效的治疗方案。

参考文献：

1、Bioprocess：Making Safe and Effective CAR T Cells: How Droplet Digital PCR Can Improve Their Quality Control

2、微基生物：ddPCR介绍