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药物的免疫原性是指药物和/或其代谢物诱发对自身或相关蛋白的免疫应答或免疫相关事件的能力。免疫反应的产生影响广泛，从无临床意义抗药抗体的暂时出现，到能够改变药物药效或产生副作用，甚至严重到危及生命，因此免疫原性研究一直是药物研发的重要组成部分，贯穿药物研发-非临床研究-临床研究-上市后药物监测的整个生命周期。药物免疫原性研究有利于优化药物临床使用方案，提高药物的临床应用范围，降低副作用，甚至决定了药物研究的成败。
对于大多数药物，不良免疫反应一般由体液免疫机制介导的免疫应答所致，因此抗药抗体一直是定义该类药物免疫原性的主要标准。免疫原性研究是药物评价的一个难点，涉及免疫学、药理学、毒理学、临床医学、统计学等多个学科，存在诸多不确定因素，本文就药物免疫原性的分析进行简单梳理。免疫原性研究原则适用于治疗性蛋白质、多肽及其衍生物，以及含有此类组分的药物，例如抗体偶联药物。其他具有潜在免疫原性风险的药物也可参考。
免疫原性的形成机制
药物引起的机体免疫反应既包括非特异免疫反应和特异性免疫反应。非特异免疫是人体防卫功能第一道防线，一般讨论较少。特异性免疫反应，按介导效应反应免疫介质的不同，可分为T细胞介导的细胞免疫反应，以及B细胞介导的体液免疫反应。
细胞免疫过程包括T细胞的分化以及细胞因子的释放，引起不同T细胞亚型比例的变化和外周细胞因子水平的变化。
体液免疫主要由B细胞产生的针对治疗性蛋白的抗药抗体（anti-drug antibodies, ADAs）引起。抗药抗体不仅包括结合药物的抗体（binding antibodies，BAbs），也可以是阻断其功能的中和抗体（neutralizing ADAs，NAb）。根据产生机制通常可分为T细胞依赖途径和非T细胞依赖两种机制。实际上，由于免疫复合物或者聚集物都能够从不同程度上激活这两种途径，并且，两种途径均会产生ADA，彼此相互作用，相互增强彼此作用。
图 1 免疫原性机制影响免疫原性的因素
药物均有诱发免疫反应的潜能，但不同的治疗性药物诱发的免疫反应强度不同。免疫原性的受多因素影响，如：患者背景（遗传、预存状态）、药物（结构、尺寸、序列以及杂质、制剂等）、治疗方式（给药方式、频次、持续时间等）等。
表 1 免疫原性影响因素
免疫原性对药物的影响
不必要或非预期的免疫应答一方面可导致机体产生抗药抗体（Anti-drug antibodies，ADA），包括抗药抗体、中和抗体、免疫复合物、抗独特型抗体等，ADA可中和药物的生物学活性，影响药代动力学参数、甚至可导致药物疗效降低或缺失。特别是当这种不必要或非预期的免疫应答与内源性蛋白产生交叉免疫反应，可能带来严重的临床安全问题。免疫原性影响贯穿药物研发的整个生命周期，从物质筛选直至上市批准后都应该对免疫原性以及带来的临床影响进行监测。
免疫原性评价策略
免疫原性的评估可以从完全理论上的模拟计算，到临床前体内外实验预测，再到临床给药后直接监测受试者的免疫反应。FDA总结开发了TCPro预测工具，用于T细胞表位预测辅助进行免疫原性评估。
图 2 TCPro免疫原性体外实验主要通过检测细胞因子评价，MHC II抗原结合是另一种体外免疫原性评价方法。
最能反应药物免疫原性的方法是观察给药后免疫系统的反应，在临床实验前，转基因动物和非人灵长类动物的免疫反应与人最为相似，是免疫原性体内分析的最佳模型。
表 2 免疫原性评价方法
检测临床受试者血清中的抗药抗体是目前监管机构要求的免疫原性评价方法。目前FDA，USP，EMA，NMPA普遍推荐通过抗药抗体的检测来评价药物的免疫原性。目前检测策略是层级递进的，包括筛选-确证-鉴别三个层级，而在第三个分析层级-鉴别层级中，目前研究较多是滴度分析和中和抗体分析。
图 3 评价策略筛选实验是整个层级分析的开始，应尽可能检测出全部的潜在阳性样本，可以允许存在一定的假阳性样本（一般为5%）。筛选实验的结果判断是基于统计的判定方式，使用药物未暴露人群的血清作为参考设置阳性样品判定的cut-off值，将高于cut-off值的样品判断为阳性。
由于筛选实验天然有5%的假阳性样品，在筛选实验得到的阳性样品需进一步进行确证。确证实验一般采用同筛选实验相同的检测方法，在样品检测过程中加入一定量的药物竞争结合抗药抗体。如存在抗药抗体，则检测信号明显下降。为提高阳性样本的可信度，确证实验的假阳性率一般设置在1%。
经过筛选和确证得到的阳性样本即为抗药抗体阳性样本，根据研究需要可对抗药抗体的浓度水平进行半定量检测-滴度实验。滴度实验与筛选实验使用相同的检测方法，以样品检测值高于cut-off值的最大稀释倍数作为样品的滴度。
另外为了评估产生的抗药抗体是否影响药物的生物学活性，需要进行中和抗体检测。中和抗体的检测方法必须基于药物的作用机制进行设计。
抗药抗体检测方法
免疫原性研究主要聚焦在抗药抗体的检测和表征上，应分析抗药抗体的发生率、滴度、持续时间和中和能力等数据。抗药抗体的可通过生物分析平台来完成，包括ELISA（ Enzyme-linked immunosorbent assay）、ECL（Electrochemiluminescence）、RIA（Radioimmunoassay）、 SPR（Surface plasmon resonance）。用于筛选和确认ADAs的免疫测定可以使用多种形式和检测系统进行。
图 4 分析方法ADA产生往往是比较复杂混合物，通常是多克隆的，与不同区域结合，不同亚型和不同亲和力，因此对ADA分析方法的选择上要尽量针对其特异性的结合区域，以充分评估药物的真实免疫原性。
表 5 分析方法优劣
抗药抗体检测之阳性对照抗体
检测抗药抗体一般需要阳性对照抗体、阴性对照，是评估方法学性能的关键试剂，阳性对照抗体直接影响检测方法的灵敏度。理想状况下，阳性对照抗体应能够反映药物在受试个体中的免疫应答情况。因此，选择合适的阳性对照抗体对抗药抗体检测方法学的开发和验证至关重要。阳性对照抗体可通过免疫动物或从商业公司购买获得。 一般选择免疫动物制备多克隆抗体作为阳性对照抗体。对于临床研究，如可获得人的抗药抗体，则可考虑优先采用。如 对于治疗性单克隆抗体，应特别考虑阳性对照抗体的代表性，建议首先根据抗体的结构类型（如嵌合、人源化或全人源）评估其在受试动物或人体中可能产生的抗体所针对的结构域或抗原表位，然后选择合适的免疫原针对性地制备阳性对照抗体。作为备选，有时也可选用单个或多个单抗的组合作为阳性对照抗体。如面临无法制备阳性对照抗体的特殊情况，可以考虑采用替代手段，但需阐明采用替代手段的科学性和合理性。当检测模式为桥连法时（如对于单抗类药物），阳性对照抗体理论上无种属限制和免疫球蛋白亚型限制，但应注意IgG4亚型不适用。阳性对照抗体一经确定，即可用于评价灵敏度、选择性、 特异性、重现性等方法学特性。在方法开发和验证过程中，应采用阳性对照抗体制备高、中、低不同浓度的质控或系统适用性对照。中浓度质控有利于在方法学验证过程中评估方 法学的精密度，考察在较宽的抗药抗体浓度范围内方法学表 现是否可被接受。对于常规的抗药抗体检测，监测系统适用性可只用高、低浓度质控样品。建议高浓度阳性对照选择没 有钩状效应的信号曲线高端对应的浓度，或者模拟样本中预 期最高浓度水平。中浓度阳性对照应选择标准曲线中段浓度 点。建议采用统计的方式确定低浓度阳性对照样品的浓度， 一般以1%的分析批拒绝率来进行计算。对于非临床研究，可根据灵敏度确定试验的标准曲线，采用1.5~2倍阴性对照或1.5~2倍筛选临界值仪器响应值或其转换值对应的浓度作为低浓度阳性对照样品。
昭衍服务内容
快速阳性抗体制备服务
服务分类：多克隆抗体、单克隆抗体
动物种属：鼠、兔、羊、猴等
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