【技术】凯莱英积极发展纯化用层析填料，助力生物药产业链发展|凝胶_新浪财经

转自：凯莱英Asymchem

在生物药的生产过程中，分离纯化工艺直接关系到生物制药的生产效率与制品的质量，可谓是整个生产流程中最重要的一环。其中，色谱（层析）技术是最为重要的分离纯化手段之一，具有分离条件温和、分离效果好、操作精度高、适用范围广等多种优势。色谱（层析）纯化同时也是单克隆抗体、融合蛋白、疫苗等生物大分子药品的核心生产环节和主要成本所在，以单克隆抗体生产为例，下游分离纯化环节占据了整个生产成本的65%以上。

随着生物制药行业的发展，我国制药企业对色谱填料的需求也随之增长；但色谱填料作为高技术壁垒领域，市场长期被国外大型供应商垄断，导致了生产成本高及供应链不够稳定。虽然近年来涌现出一批国产色谱填料供应商，其市占率逐年上升，对国外厂商形成了一定的挑战局面，但整体来看，国产填料的市占率仍有很大的提升空间。

依据化学结构的不同，色谱填料可分为软胶、硬胶两大类。软胶类填料主要以天然多糖类材料作为基质，如琼脂糖、葡聚糖等，其特点是历史悠久，亲水性良好，非特异性吸附低，因而广泛应用于纯化色谱中，其中又以琼脂糖系列填料最为普及。琼脂糖是从红藻中提取出来的一种天然多糖，可通过适当的方法加工为多孔凝胶。琼脂糖软胶填料最初于20世纪50年代开始商业化，经过半个多世纪的发展，已经形成了凝胶过滤、离子交换、亲和层析、疏水层析等适用于多种分离模式的产品线。

琼脂糖的结构

硬胶填料以人工合成的刚性有机聚合物（聚丙烯酸甲酯类、聚苯乙烯-二乙烯苯类等）为基质材料。其中，以聚苯乙烯-二乙烯苯类填料应用最为广泛。相比软胶填料来说，硬胶类填料的机械强度更佳，对极端pH、高温、高反压等恶劣条件的耐受性更好，寿命更长，便于用户进行高通量、快速的纯化操作；而且，硬胶类填料的微观结构、粒径分布等参数的可控性更强，厂商可根据需要设计出具有特殊孔道结构及特殊孔径的填料，便于纯化各种不同性质的生物制品。此外，通过多步修饰，硬胶类填料也可进行衍生化，得到如离子交换型、亲和型等特化类型的填料。

面对分离纯化填料急需国产化替代的现状，凯莱英医药集团（股票代码:002821.SZ/6821.HK，以下简称“凯莱英”）于2022年成立了制药新材料中心（Institute for Advanced Pharmaceutical Manufacturing, IAPM），针对新型分离材料投入资源，进行全面、积极的探索与开发。目前，IAPM已推出软胶（琼脂糖填料）、硬胶（单分散聚苯乙烯填料、超大孔聚苯乙烯填料）、氧化硅磁珠等多个产品线，配基种类丰富，适应客户在纯化领域的广泛需求，并可为客户在较短周期内提供填料产品与纯化工艺的定制服务，助力客户达到最佳分离效果。

IAPM的产品目录如下：

软胶系列填料

① 凝胶过滤系列 – 现提供APMrose 4B/6B/4FF/6FF四种产品，其中4FF、6FF两款应用较为广泛，是4B、6B经过进一步交联而形成的高强度多孔凝胶，可在高流速下应用。其表面官能团为琼脂糖羟基，未经过进一步修饰，分离生物大分子的原理为尺寸排阻作用，可用于蛋白、质粒、病毒载体等生物制品的最终精纯步骤。

② 离子交换系列 – 现提供Q/DEAE/SP/CM APMrose FF系列产品，分别对应强阴离子交换、弱阴离子交换、强阳离子交换、弱阴离子交换四种模式。这四种树脂表面所偶联的配基不同，可用于分离纯化在特定pH条件下带电荷的目标分子，或除去体系中带电荷的杂质（如内毒素），可被纯化的体系如单抗、病毒载体、核酸等。

③ 亲和层析系列 – 亲和层析是一种利用待纯化物质与配基的特异亲和作用达到分离目的的层析模式。IAPM现提供Ni-IDA/NTA、苯硼酸亲和、GST亲和、2-巯基吡啶亲和四款亲和层析产品。

i.Ni-IDA/NTA利用镍原子与组氨酸的特异配位作用，达成对组氨酸标签（His-tagged）蛋白质的选择性纯化功能；

ii.苯硼酸亲和树脂中的苯硼酸基团与顺式1,2-二羟基化合物有特异性反应，可选择性纯化糖蛋白、核苷等具有此类结构的生物分子；

iii.GST亲和树脂键合有谷胱甘肽（glutathione），对谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）标签蛋白有特异亲和性，可对其进行选择性纯化；

iv.2-巯基吡啶树脂，用于选择性分离开环形态与闭环超螺旋形态的质粒DNA。

④ 疏水层析系列 – 这种模式中，被分离物中的疏水部分与层析填料中的疏水配基在高盐浓度环境下产生较强的疏水相互作用。通过逐渐降低盐浓度梯度，即可达到洗脱和分离的目的，可分离具有疏水性、两亲性的蛋白和多肽等。IAPM提供丁基、苯基（高/低密度）三种疏水层析填料，可用于不同纯化目的。

APMrose系列琼脂糖凝胶填料机械稳定性好，可耐受高流速，且排阻性能优异，已与国内外先进产品的性能指标看齐：

左图：APMrose 6FF与国外先进产品的流速-柱前压（反压）比较结果；

右图：APMrose 6FF与国外先进产品的排阻性能比较结果。

APMrose 6FF与国外先进产品的形貌比较（光学显微镜下）

以下为客户应用案例，对比了Ni NTA APMrose与国外某先进Ni NTA金属螯合树脂应用于某组氨酸标签蛋白纯化的效果（分子量4.1 kDa）。经电感耦合等离子发射光谱仪（ICP）检测，APMrose与对比产品的Ni含量均为21 µmol/mL填料，且实际分离效果一致。

图：Ni NTA APMrose与对比产品的分离效果（UV监测结果）

图：Ni NTA APMrose与对比产品的分离效果（琼脂糖电泳结果）

硬胶系列填料

IAPM的硬胶系列填料基于高强度、耐酸碱的苯乙烯-二乙烯基苯骨架开发，目前已形成了单分散填料、超大孔填料两个不同的产品线。

①单分散填料

单分散填料是指微球粒径均一的填料，其具有如下特点：

• 微球为刚性微球，机械强度高，有机溶剂中床层高度变化小；

• 批次内、批次间稳定性更佳；

• 反压低、流速高，生产效率高；

• 具有优良的分辨率，适用于蛋白质、多肽与寡核苷酸的纯化；

• 单分散微球表面受力均匀，不易破碎，有更长的使用寿命。

基于以上优势，单分散填料目前已广泛应用于各类生物制剂的纯化中。

单分散填料的制备始于挪威科学家Ugelstad的课题组，该课题组于1983年发明了两步或多步种子聚合法，制备了 5-30 µm范围内的单分散聚合物多孔微球。目前，市面上商品化的单分散填料绝大多数均基于此法制备。IAPM提供两种粒径（15 µm、30 µm）的单分散填料，并涉及几种常见的分离模式（RPC、Q、SP等）。

左图：IAPM所制备的单分散填料（MonoSize 15 RPC）与竞品形貌对比；

右图：MonoSize 15 RPC粒径分布与尺寸跨度（单分散性）对比。

超大孔填料

超大孔填料又称为灌注色谱填料，是一类具有两级孔径结构的苯乙烯微球填料。填料内部分布着两种结构的孔隙，一种是贯穿整个颗粒的特大孔，其孔径一般在亚微米级，称为穿透孔或对流孔；另一种是连接这些特大孔的较小一些的孔，称为连接孔或扩散孔，孔径为数十至百余纳米，如下图所示：

传统的多孔聚合物填料中孔径通常较小，被分离物主要依靠扩散作用到达填料内部。尺寸较大的被分离物扩散慢，因此常常来不及到达填料内部就直接被流动相冲走，导致分离效果变差。相比于传统的多孔聚合物填料，超大孔填料颗粒中的传质主要靠贯穿特大孔中的对流传递，生物大分子溶质能够随流动相的液流迅速达到孔内活性表面上，因此整个传质过程很快，孔内停滞流动相的传质阻力大大减小，提高了柱效。因此，特别适合于分离分子量较大、扩散困难的生物制品，如核酸等。IAPM目前可供应粒径为20 µm、50 µm的两种GPR系列填料，且表面可根据需要，修饰Q、SP、NHS、环氧等基团。