Science子刊：王永明/兰峰团队开发出高特异性CRISPR-Cas12j工具|基因_新浪财经

转自：药时空

脱靶是人们最担心的问题，它可能会破坏正常基因，引发癌症。另外，很多显性基因突变是单碱基突变，如果能选择性的敲除突变等位基因，只保留正常等位基因，就能达到治疗效果。这就要求CRISPR-Cas系统有极高的特异性。到目前为止，II类的Cas9和V类的Cas12被广泛开发为基因编辑工具。SpCas9是第一个开发出来的Cas9，也是应用最广泛的Cas9，但是脱靶严重。随后科研人员通过改造SpCas9或者开发新的CRISPR-Cas系统来提高特异性，但是区分单碱基突变依然是一个挑战。

复旦大学王永明课题组致力于系统的开发CRISPR-Cas工具，满足不同场景的应用。王永明课题组建立了鉴定Cas活性的新思路，将基因编辑和GFP表达偶联，实现了在哺乳动物细胞中对CRISPR-Cas系统的快速筛选。团队先后对300多个Cas9进行鉴定，开发出一系列性能优异的小型Cas工具酶，可被单个AAV包装递送，是基因治疗的理想工具。该课题组于2020年3月开发出的SauriCas9，识别NNGG PAM；2021年4月开发出SlugCas9-HF，特异性大幅提高，而编辑活性和SpCas9相当；2021年12月开发出SchCas9，识别更简单的NNGR PAM；2022年8月开发出Nsp2Cas9及其嵌合体核酸酶，分别识别N4CC和N4C PAM；2022年11月开发出Sha2Cas9-HF和SpeCas9-HF，识别NNGG PAM，特异性和活性都很高；2023年2月开发出Hsp1-Hsp2Cas9-Y，识别N4CY PAM。这些研究不断扩大编辑范围，提高编辑活性和特异性。

2023年2月10日，复旦大学王永明课题组联合阜外医院兰峰课题组在 Science Advances 期刊发表了题为：A highly specific CRISPR-Cas12j nuclease enables allele-specific genome editing 的研究论文。该研究开发出了特异极高的Cas12j-8工具，能够区分单碱基突变。

Cas12j是最近发现的一类CRISPR-Cas系统，基因很小，只包含crRNA和Cas12j两个元件，不需要tracrRNA。研究团队在哺乳动物细胞中对6个Cas12j蛋白进行筛选，发现Cas12j-8和Cas12j-10具有编辑活性。它们识别TTN PAM，编辑范围较大（图1）。

图1. Cas12j-8识别TTN PAM，编辑范围大

研究团队随后比较了Cas12j-8、SpCas9、AsCas12a的编辑活性。在11个测试位点中，Cas12j-8编辑活性比SpCas9略低，比AsCas12a高（图2）。

图2. Cas12j-8 的编辑活性比较

研究团队又分析了Cas12j-8的特异性。利用GFP激活表达系统测试特异性。GFP含有一个插入片段，造成移码突变。对插入片段进行编辑，产生indel，会在一部分细胞中产生整码突变，GFP得以表达。设计一系列含有单碱基的crRNA靶向GFP，发现Cas12j-8特异性极高，在sgRNA1-14位不能容忍单碱基错配（图3A）。利用全基因组脱靶分析技术（GUIDE-seq）分析3个crRNA的脱靶情况，未发现脱靶（图3B），说明该Cas12j-8特异性极高。FnCas9作为对照，在一个位点检测到了两个脱靶位点。

图3. Cas12j-8 的特异性检测

Cas12j-8只有716 个氨基酸，蛋白很小。作者将Cas12j-8与腺嘌呤脱氨酶融合，开发出较小的Cas12j-8ABE8e碱基编辑器。对一系列位点进行编辑，在4个位点检测到了A到G的碱基转换，效率为5.1%-11.3%（图4）。目前基于Cas9构建的碱基编辑器太大，无法用单个AAV包装递送。AAV是基因治疗中最常用的递送载体。Cas12j-8ABE8e含有938个氨基酸，在AAV包装递送范围内，具有用于体内基因治疗的潜力。

图4. Cas12j-8ABE8e的开发

Cas12j-8蛋白具有较高的特异性，作者将Cas12j-8应用于单核苷酸多态性（SNP）位点的靶向编辑。Cas12j-8能够很好的区分单碱基差异（图5A-B）。针对Clin Var database 和dbSNP 数据库中的SNP位点进行crRNA设计（图5C），crRNAs位点数据已开放 (http://www.deephf.com/#/resources/snp-edit)。总之，Cas12j-8具有蛋白小、活性高、能区分单碱基突变的优点，具有广泛的应用前景。