【综述分享】探讨NGS检测的“神奇三角”与优化因素|基因_新浪财经

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转自：医学界

随着越来越多的靶向药物获批上市，加上第二代测序（Next Generation Sequencing，NGS）技术的出现，有望为深入理解非小细胞肺癌（Non-Small-Cell Lung Cancer，NSCLC）的生物分子特征带来一场革命。然而，现存多个会影响NGS在临床实践中成功率的因素，临床医生需要在临床实践中充分了解NGS的优劣势以及实施NGS时需要考虑的问题，基于此，来自意大利的Giovanna De Maglio等人在Critical Reviews in Oncology / Hematology[1]上发表了一篇题为“The storm of NGS in NSCLC diagnostic-therapeutic pathway: How to sun the real clinical practice”的文献综述，对以上问题进行了探讨，并提出了一个在常规实践中进行NGS检测的临床路径。

影响NGS临床效能的神奇三角：

样本、技术和Panel

组织样本是进行包括NGS在内的分子检测的“金标准”生物样本类型。然而，对晚期NSCLC患者而言，存在获取（大量）组织困难的“问题”，在绝大多数患者中，仅少量的组织样本（小的活检标本和/或细胞学标本）可用于分子检测[2]。虽然常规实施NGS分析前，福尔马林固定石蜡包埋（Formalin-Fixed Paraffin-Embedded，FFPE）的组织样本不需要额外的细胞学制备过程，如使用直接涂片法及液基细胞学（Liquid-Based Cytology，LBC）涂片法，然而，美国病理学家学会（College of American Pathologists，CAP）/国际肺癌研究协会（International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC）/美国分子病理协会（Association for Molecular Pathology，AMP）发布的最新分子检测指南[3]表明：非FFPE的样本也可在晚期NSCLC患者的分子诊断中发挥作用。事实上，与FFPE样本相比，非FFPE样本产生的核酸质量更高。FFPE样本由于受福尔马林固定而导致胞嘧啶（Cytosine，C）>胸腺嘧啶（Thymine，T）伪迹，可能导致分子诊断的假阴/阳性结果。

关于NGS的检测平台，一般采用以下三种测序方法之一：合成法、杂交法和连接法。尽管目前市面上有不同的测序平台（如Illumina，Ion Torrent等），但基本的工作流程都遵循相同的步骤：（1）文库制备（2）簇生成：单个生成片段的克隆扩增（3）大规模并行测序（4）数据分析。

NGS分析的另一个关键步骤是选择能够满足诊断目的的Panel。目前市场上有不同的Panel，可根据情况分别采用：小Panel，涵盖10-15个基因；临床相关Panel，涵盖多达50个基因，有助于将患者纳入临床试验；肿瘤综合Panel，涵盖多达150个癌症特异基因，用于转化研究；人类癌症综合Panel，涵盖多达400个癌症相关基因。

综上，结合质量和DNA/RNA产量方面选择最合适的样本，并采用能在特定分析环境中最大限度提高临床灵敏度的NGS测序技术，再结合临床环境选择最合适的Panel，就能够获得最合适的NGS结果（图1）。

图1.影响NGS效能的“神奇三角”

优化NGS检测的四点关键因素

尽管广泛的分子标志物检测方法对肺癌患者的重要性已达成共识，但在全球临床实践中的应用仍存在困难。最近的一项IASLC国际调查[4]显示，全球范围内的肺癌分子检测率普遍不高，超过60%的调查对象中，分子检测的采用率低于50%，大多数患者只检测了EGFR和ALK这两个靶点。造成此现象的原因主要在于检测成本、途径、质量、周转时间和检测意识等方面存在障碍。NGS检测技术的出现有望成为NSCLC生物分子表征的潜在革命，目前优化NGS检测需要关注以下四点关键因素。

单基因检测尚未过时：

由于大多数病理实验室在过去十年中都配备了单基因分析平台，因此技术更新以及设备维护和正交试验法方面的专业知识至关重要。临床上不能认为单基因检测策略已经过时，因为单基因检测虽只覆盖有限的突变/重排检测范围，但当要求快速周转或样本的质量和数量不适合进行NGS检测时，单基因检测便能发挥其作用。同时针对病情恶化的患者，在进行NGS检测时，同步进行单基因的快速检测，对挽救患者生命至关重要。

液体活检作为组织活检的补充：

虽然应尽可能对NSCLC患者进行更广泛的基因组评估，但目前关于将液体活检作为组织活检的补充方法观念已形成广泛共识。即使液体活检尚未完全替代组织检测，但在晚期NSCLC初诊时建议进行液体活检分析，特别是针对肿瘤组织稀缺、不可用或对于那些侵入性操作可能有害的患者。同时，NILE研究[5]也证实了对于转移性NSCLC，液体活检技术与组织检测的检出率相同，且检测出报告速率比组织检测更快。

周转时间-测序的选择：

国际CAP/IASLC/AMP指南[3]建议分子检测的周转时间不应超过10个工作日。然而，在实际临床实践中，NGS周转时间的延迟，通常与logistic因素有关。既往研究表明，NGS比序贯检测的耗时更短。另一项研究[6]显示，序贯检测仅限于EGFR、ALK和ROS1的检测分析才具有成本效益。因此，从时间消耗和成本控制的角度，基于DNA和RNA的综合性NGS检测方法更具有同时评估突变、重排和扩增的优势。

周转时间-实验室的优化：

另外，优化整个NGS检测的工作流程对缩短周转时间也同样重要，包括组织采集后选择最合适的分析样本、进行检测的时间等。分子实验室的选择在工作流程中扮演了重要角色。实验室必须配备不同的检测平台（包括单基因和多基因测序），在出现具有挑战性和罕见性的NGS结果时，也可用于正交确认检验。同时配备不同的工作流程以适应不同的临床环境，以此进行严格执行和管理。

· 小结 ·

随着“精准医疗”时代的来临，在过去的十年中，相比传统的检测技术，以低成本、高准确度、高通量和快速检测为优势特征的NGS检测技术，成为目前最常用的基因检测手段之一。NGS不仅降低了测序成本，还提供了有价值的基因组微观信息，已经被国内外多个权威指南与共识[7-15]推荐用于癌症研究领域和临床实践。

但是将NGS广泛应用于临床，仍有许多重要问题亟待解决。除了本文提及到的是否结合单基因检测和液体活检作为NGS的补充、如何进行Panel选择，如何制定实验室标准化的工作流程缩短NGS检测的周转时间等问题，还需考虑患者检测费用的问题。相信未来在国家和各方的共同努力下，将有望不断解决现存问题，完善医院实验室和设备平台的建设，提高医患对NGS的认知水平，推动NGS从“外检”落地“院内”，让NGS检测技术成为早期筛查、早期诊断、治疗决策和癌症风险指导中最为有力和精准的工具，造福更多癌症患者！

参考文献：

[1]De Maglio G, Pasello G, Dono M, et al. The storm of NGS in NSCLC diagnostic-therapeutic pathway: How to sun the real clinical practice[J]. Critical Reviews in Oncology/Hematology, 2022, 169: 103561.

[2]Aisner, D.L., Rumery, et al. 2016. Do more with less: tips and techniques for maximizing small biopsy and cytology specimens for molecular and ancillary testing: the University of Colorado Experience. Arch. Pathol. Lab. Med. 140, 1206–1220.

[3]Lindeman, N.I., Cagle, et al., 2018. Updated molecular testing guideline for the selection of lung cancer patients for treatment with targeted tyrosine kinase inhibitors: guideline from the college of american pathologists, the international association for the study of lung cancer, and the association for molecular pathology. Arch. Pathol. Lab. Med. 142, 321–346.

[4]Smeltzer, M.P., Wynes, et al. 2020. The international association for the study of lung Cancer Global survey on molecular testing in lung Cancer. J. Thorac. Oncol. 15, 1434–1448.

[5]Leighl, N.B., Page, et al. 2019. Clinical utility of comprehensive cell-free DNA analysis to identify genomic biomarkers in patients with newly diagnosed metastatic non-small cell lung Cancer. Clin. Cancer Res. 25, 4691–4700.

[6]Layfield, L.J., Hammer, R.D., White, S.K., Furtado, L.V., Schmidt, R.L., 2019. Molecular testing strategies for pulmonary adenocarcinoma: an optimal approach with cost analysis. Arch. Pathol. Lab. Med. 143, 628–633.

[7]Matthijs G, Souche E, Alders M, et al. Guidelines for diagnostic next-generation sequencing. Eur J Hum Genet, 2016, 24(1): 2-5. doi:10.1038/ejhg.2015.226

[8]Jennings LJ, Arcila ME, Corless C, et al. Guidelines for validation of next-generation sequencing based oncology panels: a joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists. J Mol Diagn, 2017, 19(3): 341-365.doi: 10.1016/j.jmoldx.2017.01.011

[9]Hume S, Nelson T N, Speevak M, et al. CCMG practice guideline: laboratory guidelines for next-generation sequencing[J]. Journal of medical genetics, 2019.

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[11]《临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识》编写组. 临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识. 中华病理学杂志, 2017, 46(3): 145-148.] doi: 10.3760/cma.J.issn.0529-5807.2017.03.001

[12]中国临床肿瘤学会肿瘤标志物专家委员会, 中国肿瘤驱动基因分析联盟. 二代测序技术在肿瘤精准医学诊断中的应用专家共识. 中华医学杂志, 2018, 98(26): 2057-2065. doi: 10.3760/cma.J.issn.0376-2491.2018.26.001

[13]冯刚,熊蓉,刘康.《二代测序技术在肿瘤精准医学诊断中的应用专家共识》评述[J].西部医学,2020,32(11):1561-1564

[14]周彩存,王洁,程颖等.二代测序技术在NSCLC中的临床应用中国专家共识(2020版)[J].中国肺癌杂志,2020,23(09):741-761.

[15]中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会, 中华医学会血液学分会, 中华医学会病理学分会. 二代测序技术在血液肿瘤中的应用中国专家共识（2018年版）. 中华血液学杂志, 2018, 39(11): 881-886.doi: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2018.11.001

*本材料由阿斯利康提供，仅供医疗卫生专业人士参考

审批编号CN-127536过期日期2024-10-11