江南大学团队打造新一代碱基编辑器,编辑窗口最高可达41nt,可用于高版本工业底盘菌株开发

江南大学团队打造新一代碱基编辑器,编辑窗口最高可达41nt,可用于高版本工业底盘菌株开发
2024年05月26日 17:19 DeepTech深科技

来源:DeepTech深科技

我们开发的新一代碱基编辑器,在高版本工业底盘菌株开发中具有巨大潜力。审稿人表示这是基因编辑技术领域的一项重要突破。”江南大学助理研究员韩来闯表示。

图 | 韩来闯(来源:韩来闯)

近日,他和所在团队利用复合体结构导向的 Cas 蛋白优选、融合方式优化等手段,将碱基编辑器的编辑窗口大幅提至最高 41nt。

这极大拓展了碱基编辑器的应用范围,让利用碱基编辑器来构建细胞突变库成为可能,也让创制高性能底盘菌株成为可能。

在碱基编辑器工作原理上,课题组也实现了新的突破。其发现,基于序列和蛋白结构的比对分析,可以更好地确定 Cas 蛋白功能关键位点并加以改造。

此外,他们还探索了不同融合方式对于编辑窗口的影响,并将其与 Cas 蛋白和脱氨酶空间位阻效应进行关联。

研究中,他们在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌这两个重要模式细菌中加以测试。

通过在枯草芽孢杆菌的启动子和核糖体的结合位点,引入大范围的突变和筛选,他们获得了一种“启动子+核糖体”的结合位点组合。

相比出发组合的表达强度,本次组合的表达强度提升了 68.1 倍。

针对大肠杆菌 Tat 分泌系统的关键基因,课题组也进行了原位改造,借此筛选得到一种底盘细胞,它的分泌能力同比提升 6.49 倍。

总的来说,本次研究瞄准工业菌株改造的痛点,探索了 Cas 蛋白选择、脱氨酶融合方式等因素对于编辑窗口的影响,展示了生物结构分析对于基因编辑系统开发的重要作用。

(来源:Advanced Science)(来源:Advanced Science

亟需开发性能更优的底盘细胞

当前,随着能源供给、粮食安全、环境压力等问题变得日益严峻,如何实现绿色可持续的发展,是人类共同关注的话题。

在这种情况之下,合成生物学应运而生。它是指在工程学思想的指导之下,对生物体进行有目标的设计、改造,甚至创建拥有非自然功能的“人造生命”,即实现生命系统的工程化。

继“发现 DNA 双螺旋结构”和“人类基因组测序计划”之后,合成生物学被认为是人类的第三次生物技术革命。

作为一种底层技术,合成生物学已经在多个行业中产生了深远影响,包括生物发酵、化工、食品、医药等,并正快速向环境、农业、材料、能源等行业延展。

它的广泛应用和快速发展,证明其在实现绿色制造、碳中和、大健康等宏大目标中具备巨大潜力。

毋庸置疑,合成生物学将给传统生产制造方式带来深刻变革。工业菌株,是合成生物制造的“灵魂”。高版本的工业底盘菌株的创制,是合成生物学的研究热点。

这是因为通过优化底盘菌株,可以进一步提高生物制造过程的效率和产量,从而推动相关行业的快速发展。其中,高效的基因编辑技术扮演着关键角色。

目前,人们已经发展出多种基因编辑技术,并且各有各的特色。

其中,CRISPR-Cas 基因编辑技术是一款革命性的基因编辑工具,自 2012 年诞生以来便在生医领域引起了巨大轰动。

相比传统的基因编辑技术,CRISPR-Cas 具有成本低、易操作、效率高等优势。

此前,通过利用 Cas 蛋白的核酸切割活性,人们已经实现了基因失活、无痕敲除、外源基因重组等功能。

而更为重要的是,CRISPR-Cas 的精准定位特性,为基因编辑带来了无限可能。

比如,使用失去核酸切割活性的 Cas 蛋白融合转录因子,可以改变基因的表达强度,从而能被用来打造基因表达调控系统。

再比如,使用失去核酸切割活性的 Cas 蛋白融合具备报告功能的蛋白,因此可以作为标记工具来使用,进而用于细胞成像。

不同于利用 CRISPR-Cas 系统切割功能的基因改造,当把碱基脱氨酶融合在 Cas 蛋白上的时候,在 Cas 蛋白精确定位的帮助之下,脱氨酶可以在基因的特定位置发挥作用。

这让脱氨酶可以直接通过酶催化的方式,来改变基因的碱基序列,人们将该系统形象地称为“碱基编辑器”。

对于这种基因编辑过程来说,它不会对基因进行切割,所以不会导致基因结构被破坏。这让它不仅具备较高的效率,对于宿主细胞的压力也相对较小。

事实上,针对蛋白质或细胞进行改造,本质上都是在基因层面引入突变,从而改变生物活性。

然而,受限于当前的遗传操作技术水平,对于绝大多数基因来说,都很难通过克隆和体外基因工程操作进行改造。

而一些多组分系统,它们不仅含有较大的基因簇,功能也非常复杂。因此,只能在基因组上进行原位改造。

碱基编辑器,是在原位改造基因的有效工具,它能定点地改变基因序列,也能构建包含多种突变的库,从而可以进行表型筛选。

不过,编辑窗口难题——是碱基编辑器当前面临的主要限制因素之一。

之前的碱基编辑器,通常只能编辑 5-7nt 范围的碱基,最多只能发生 2-3 个氨基酸的突变,这极大限制了碱基编辑器的应用。

而之所以开展本次工作,是基于课题组长期从事生物催化研究时所遇到的问题。

从酶和表达宿主的匹配性角度来看,不同的酶需要选择合适的宿主来表达,但是在同一宿主内表达不同的酶,其效果又会大相径庭。

从酶的表达方式角度来看,有些酶适合胞内表达,有些则适合分泌到细胞外表达。

为此,该团队曾做过大量的表达系统,比如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母、丝状真菌等。

对于一些复杂的级联催化反应来说,需要针对酶的协同表达进行严密调控。此外,有些基因只能在体内发挥功能,很难克隆出来进行改造。

在这些问题的背后都指向着一个共同问题:如何高效地开发性能更优的底盘细胞。

经过一番调研,他们认为 CRISPR-Cas 技术是解决上述问题的较优选择。

(来源:Advanced Science)(来源:Advanced Science

积极拥抱 AI 技术,为开发碱基编辑器提供重要依据

在此之前,该团队曾使用 CRISPR-Cas 技术分别在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和构巢曲霉中构建了相关系统,实现了基因敲除、基因敲入、以及调节基因表达。

在此基础之上,他们决定将 CRISPR-Cas 技术的开发和应用,作为本次研究的重点之一。

如前所述,尽管基因编辑技术已经取得了一定进展,但在处理大基因簇和复杂多组分系统上仍然存在局限性。

因此,他们决定将研究焦点放在如何扩展碱基编辑器的编辑窗口上,以便提高其应用范围。

在实验设计阶段,课题组综合考虑了 Cas 蛋白的选择、脱氨酶的融合方式等多个因素对于编辑窗口的影响。

通过对比分析和结构预测,筛选出了具有潜在优势的 Cas 蛋白,并通过设计不同融合方案进行测试。

同时,他们还构建了一系列的测试载体和底盘菌株,以便验证碱基编辑器的性能和应用潜力。

通过比较不同编辑窗口之下的编辑器性能差异,评估了构建突变库的稳定性和可靠性。

并利用生物信息学手段,针对编辑结果进行预测和验证,进一步证实了编辑器的准确性和有效性。

另外,他们还通过使用基于深度学习模型的结构预测工具 RosettaFoldNA,来对 Cas 蛋白-核酸的结构进行预测分析,这为碱基编辑器的开发提供了重要依据。

(来源:Advanced Science)(来源:Advanced Science

后续,他们将继续开展三方面的工作:

其一,基于碱基编辑器的基因,提升原位改造技术的应用能力。

届时,他们将在典型模式菌中开展上述探索,针对所感兴趣的生物功能系统的关键基因来构建突变体库,从而获得性能优良的底盘细胞。

其二,开展非模式菌株的适用性研究。

尽管本次系统在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中具备良好的验证效果,但是这远远不够。

工业菌株种类繁多,很多都是非模式菌株。因此,他们将在非模式菌株中测试本次工具,针对一些适配性问题加以优化,拓展本次技术的应用范围。

其三,开发性能更佳的基因编辑系统。

基因原位改造的方式,不仅繁多而且各有优势。因此,课题组将仍以“基因原位突变体库构建和改造”为落脚点,开发新的基因编辑系统。

与此同时,该团队也正在使用 AI 序列生成模型,来设计人工脱氨酶、优化 Cas 蛋白和脱氨酶的融合方式等。

其认为 AI 的快速发展一定会颠覆传统的生物技术研究方式,即从之前的机制驱动(先理解再设计),转变为数据驱动(先设计再理解)。

参考资料:

1.Hao, W., Cui, W., Liu, Z., Suo, F., Wu, Y., Han, L., & Zhou, Z. (2024). A New‐Generation Base Editor with an Expanded Editing Window for Microbial Cell Evolution In Vivo Based on CRISPR‒Cas12b Engineering.Advanced Science, 2309767.

支持:Ren

排版:初嘉实

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