7种基于TCR疗法的分子结构|多肽_新浪财经

转自：药时空

T细胞受体(TCR)复合体是一种天然产生的抗原传感器，它检测、放大和协调细胞对来自细胞表面和细胞内蛋白的表位的免疫反应。TCR能够靶向肿瘤细胞选择性表达的蛋白质，包括新抗原、癌胚抗原和病毒癌蛋白。因此，TCR为新兴的肿瘤治疗提供了基础。在这里，介绍目前使用TCRs和TCR-like分子治疗肿瘤的前景。这包括表达内源性或工程TCR的T细胞过继细胞转移、TCR双特异性结合分子和HLA结合多肽的特异性抗体(TCR mimic)。

与细胞表面和可溶性表位生理结合的抗体不同，TCRs可以对来自整个癌细胞蛋白质组的抗原做出反应。这包括约88%的蛋白质，这些蛋白质只存在于细胞质、细胞核和线粒体等细胞内。TCR结合细胞内抗原的独特能力，这一特性极大地扩大了可操作的免疫靶点的范围，源于它们不与完整蛋白质结合的事实。相反，它们识别结合到HLA分子上的蛋白降解多肽，这些多肽已经被运输到细胞表面用于细胞外呈递。

TCR对配体具有很高的灵敏度。肿瘤细胞表面特异性多肽/HLA(p/HLA)复合体的数量通常在1-100个分子范围内。这个数值比治疗抗体所需的分子数小几个数量级。然而，只有1-3个p/HLA复合体足以触发T细胞效应功能。同时，TCR具有显著的特异性，可以区分不同于单一氨基酸的多肽，例如由体细胞点突变或生殖系多态引起的多肽，以及相同氨基酸的不同立体异构体。

尽管有这些优点，第一个TCR疗法(Tebentafusp)直到2021年才进入肿瘤治疗的标准。相比之下，抗体及其衍生物，包括抗体-药物结合物(ADC)、双特异性蛋白和CAR修饰的T细胞，自1990s年代中期以来一直是癌症治疗的主要手段。这里介绍了天然产生的TCR的结构，并讨论了合理修改TCR的不同结构域以创造具有不同生化、功能和药理特性的受体的策略。

内源性TCR

TCR不是一个单一的分子，它是一个蛋白质的复合体，其中抗原识别和信号转导的功能被划分为不同的亚基。TCR的功能单元是由六个蛋白质组成的八聚体复合体：克隆型TCRα/TCRβ半链和不变的CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ链(图1a)。这些蛋白质按1：1：1：1的化学计量比组装，其二聚体亚基为TCRαβ：CD3δε：CD3γε：CD3ζζ。少数循环T细胞(γδT细胞)表达TCRγδ，而不表达TCRαβ。TCR半链蛋白都不具有信号转导结构域，相反，受体依赖于与CD3分子的非共价相互作用来启动细胞内信号传递、T细胞激活和细胞命运决定。CD3γ、CD3δ和CD3ε亚基是遗传相关的，只有一个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)，而CD3ζ亚基是遗传无关的，包含三个ITAMs。

在结构上，每个TCR半链由一个可变(V)结构域、一个恒定(C)结构域、一个跨膜结构域和一个短的细胞质尾组成。TCR多样性和特异性是通过涉及Vα/Vβ结构域的组合和连接多样性产生的。与免疫球蛋白可变重链(VH)类似，TCRVβ结构域的组合多样性是由胚系编码的V、多样性(D)和连接(J)基因片段组成的。Vα结构域类似于免疫球蛋白可变轻链(VL)，由链特异的V和J基因序列重组形成。重组的Vα和Vβ序列依次连接到Cα结构域(由TRAC编码)和两个Cβ结构域之一(由TRBC1和TRBC2编码)。额外的组合多样性来自重组TCRα和TCRβ半链的配对，这两个TCR半链通过位于Cα和Cβ结构域上保守的半胱氨酸残基形成的一个二硫键共价连接。

每个TCR异源二聚体包含6个序列超变区，称为互补决定区域(CDR)。CDR是从TCR的可变区伸出的环状结构，形成与p/HLA复合体的主要接触部位。在CDR之间，每个可变链都有3个框架区域，促进Vα/Vβ结构域的链间堆积和Vα/Cα和Vβ/Cβ结构域的链内界面。CDR1和CDR2环位于TCR暴露于溶剂的末端的外围，并且是胚系编码的。相反，CDR3环位于中央，并通过组合和连接多样化产生，以创建每个TCR最多态的序列。除了不同V(D)J基因片段的并置外，CDR3环中的额外多样性是通过删除和添加非模板编码的核苷酸而产生的。

大多数TCR对角对接在p/HLA复合体上，将Vα和Vβ结构域分别放置在与HLA结合的多肽的氨基末端和羧基末端。这种配置在TCR和p/HLA复合体之间建立了广泛的接口。此外，它将TCR序列多样性最大的区域（体细胞重排的CDR3环）定位在多肽的中央核心上，在那里它们有助于受体的良好特异性。相反，胚系编码的CDR1环和CDR2环主要(尽管不是排他性的)接触定义HLA分子结合槽的两个α螺旋。这些相互作用确保TCR以肽依赖的方式识别p/HLA复合体。大多数天然存在的TCR具有相对较弱的结合亲和力，典型的解离常数(Kd)测量在微摩尔范围内。相比之下，成熟抗体的亲和力一般在纳摩尔到皮摩尔之间。

●图1 基于TCR疗法的分子结构。

外源TCR与基因组编辑

原代人类T细胞的特异性可以通过表达外源TCRαβ基因序列而被基因重定向以识别肿瘤细胞所显示的p/HLA复合体(图1b)。到目前为止，整合逆转录病毒和慢病毒载体是最常见的将外源TCRs引入临床应用的方法。然而，非病毒基因组整合技术也可以使用，包括睡美人转座子/转座酶系统和CRISPR-Cas9。尽管有广泛的安全记录，但整合病毒载体具有一定的局限性。病毒以半随机方式整合，拷贝数可变，导致转基因表达异质性。此外，病毒的制造成本很高，可导致插入突变，并且具有相对有限的载货能力。最后，整合病毒载体使内源TCR半链保持不变，这除了正确配对的内源性(α/β)和外源性(α′/β′) TCR之外，这还会导致错误配对的(α′/β，α/β′)异二聚体。内源性和错配TCR的表达可能会通过竞争有限的信号分子池而影响治疗效果。此外，由于错配的TCR没有经过胸腺选择，它们可以具有新的反应性，包括对自身抗原的反应。在同基因小鼠中，T细胞表达错配的TCRs会引发致死性移植物抗宿主病(GvHD)。幸运的是，尚未在人类临床试验中观察到TCR错配导致的GvHD。

为了减少TCR错配，基于核酸酶的基因组编辑技术包括锌指核酸酶、转录激活因子样效应子内切酶和CRISPR-Cas9，可用于干扰内源性TRAC和/或TRBC1/2基因座。然而，这些策略会导致双链DNA断裂，从而有可能产生off-target的基因组效应，包括插入/缺失和染色体易位。抑制性RNA可以在不引起双链DNA断裂的情况下沉默天然TCR的表达，但这种方法不能完全降低错配的风险，因为敲除通常是不完整的。DNA碱基编辑最近被开发出来，它通过剪接位点失活或引入过早终止密码子来扰乱蛋白质的表达，而不会导致双链DNA断裂。使用DNA碱基编辑对TRAC和TRBC1/2基因座进行操作可能为内源性TCR的基因去除提供一种更安全的替代方法。

除了干扰内源TCR外，CRISPR-Cas9还可能通过模板引导的同源定向修复促进外源TCRαβ基因在TRAC基因座的靶向基因组整合。与半随机插入到基因组中的TCR相比，靶向整合同时提供了增强的功能和更可预测的安全性。靶向整合利用基因的内源性启动子实现了生理抗原受体的调节，这一特征可以防止免疫衰竭。重要的是，使用CRISPR-Cas9的靶向敲入可以通过共电穿孔Cas9 RNP和DNA同源定向修复模板以非病毒的方式执行。这一创新极大地减少了生成临床使用的TCR结构所需的时间和成本。非病毒TCR整合历来不如病毒方法有效。工艺改进可能会提高编辑率，包括单链DNA供体模板、纳米质粒、核内模板穿梭、Cas9 RNP稳定化和小分子鸡尾酒。

结构域工程

TCR结构域工程是提高外源TCR效力和安全性的另一种方法。恒定结构域和跨膜结构域的改变尤其多才多艺，因为它们适用于不同的治疗候选对象。例如，沿着Cα/Cβ界面放置额外的半胱氨酸残基有助于创建第二个链间二硫键，从而增强适当的半链配对。用全部或选定的氨基酸残基鼠源化来代替人的Cα/Cβ序列也可以减少错配。尽管这种方法引入了潜在的免疫原性外源序列，但对接受带有小鼠恒定区的TCR的患者的分析未能发现免疫原性、细胞持久性和临床结果之间的相关性。如果细胞产品中不需要异源序列，则可以将人Cα/Cβ结构域的倒置(结构域交换)作为一种替代方法来最大限度地减少错配。恒定链含有翻译后糖基化的残基，通过定点突变去除糖基化位点增强了外源TCR的功能亲和力，可能是通过改善免疫突触内的TCR聚集。最后，在TCRα的S跨膜结构域中，用脂肪残基替代非电离氨基酸可以增加TCR的表面表达。

对TCR可变区的修饰，包括框架和CDR区，也可以改善TCR的功能。与恒定和跨膜结构域改变不同，这些改变需要经验测试和优化。具有相同恒定区的外源表达的TCR在细胞表面的表达并不相同，这一发现表明可变域有助于TCR的组装和稳定性。比较高表达和弱表达TCRs骨架区域的递归氨基酸序列，发现在可变区和恒定区的交界处有3个最佳残基。对于含有次优残基的TCRs，用最佳氨基酸替代可增强表面表达和体内抗肿瘤效果。重要的是，由于骨架区域不参与抗原结合，这些部位的变化不太可能改变TCR的交叉反应特征。

对选定的CDR残基进行突变可以增强TCR的结合亲和力。这可以通过经验性测试或定向进化技术来实现。与天然序列相比，CDR1、CDR2或CDR3环的单一或组合替代可导致亲和力增加多达100万倍。除了调节结合亲和力外，CDR序列的改变也可能改变TCR的特异性。两项使用亲和力增强受体的临床试验已经导致致命的off-tumor/off-target毒性，可归因于TCR的交叉反应谱的变化。因此，在临床发展之前，有必要对亲和力增强的TCR的交叉反应谱进行详细的评估。尽管早期遭遇挫折，但许多目前处于高级临床开发中的TCR疗法已经经历了亲和力增强。最近的一种策略借鉴了高度关注特异性的领域(如DNA结合和酶催化)，即设计具有更高特异性的TCRs。这种结构导向的方法不是改变亲和力，而是寻求在TCR-p/HLA界面上重新分配有吸引力的相互作用，以减少off-target多肽识别。

proof-of-concept研究说明了捕获结合工程如何在不改变结合亲和力的情况下增加TCR效力。捕获键是在受体解离之前，在剪切力条件下瞬间形成氢键和盐桥而形成的。这会导致延长的键寿命，导致TCR信号和T细胞激活的增强。捕捉键工程可以通过将极性和带电的氨基酸引入位于p/HLA表面附近但不直接接触的CDR环来实现。这种方法的目标是促进在TCR与p/HLA复合体脱钩期间产生有利的相互作用，类似于鱼钩与猎物的接触。由于捕捉键工程TCR的亲和力通常保持在生理范围内，因此这些受体的交叉反应谱不应改变，因为直接与基态p/HLA复合体接触的残基保持不变。

可溶性双特异性TCRs

TCRαβ异源二聚体可以表达为一种可溶性的单链重组蛋白，使不需要基因工程的现成试剂得以开发。可溶性TCR可与来自激动性抗CD3ε抗体的单链可变区(scFv)融合，从而产生称为“免疫动员抗癌单抗”(ImmTAC)和“T细胞结合受体”(TCER)的双特异性蛋白(图1c)。ImmTACs和TCERs在多克隆T细胞和表达特定p/HLA复合体的靶细胞之间建立人工免疫突触。然而，为了以稳定的方式结合p/HLA复合体作为单体，CDR突变需要将TCR的结合亲和力提高到皮摩尔范围，这一值是天然产生的TCR的10^6倍。改变TCR的结合亲和力到这个程度可能会导致抗原特异性的丧失。在极端情况下，这可能导致高度混杂的受体与特定的HLA分子结合，而不依赖于结合肽的序列。因此，必须仔细评估亲和力增强的TCR的特异性，包括使用大量的抗原和不匹配的靶细胞。使用双特异性TCR重定向的T细胞对表达少至10个p/HLA分子的靶细胞表现出抗原特异性的细胞溶解作用。与单抗(75kDa和150kDa)相比，ImmTAC的分子量较小；因此，它们需要反复输注才能保持效力。延长血清半衰期，例如与修饰的IgG Fc分子融合，可能会克服这一限制。

TCR mimic

另一类双特异性T细胞结合蛋白，称为TCR mimic，使用两个抗体来源的单链抗体，通过多肽接头共价连接。一个scFv与癌细胞上的p/HLA分子表位结合，而另一个scFv与T细胞上CD3复合体的成员结合(图1d)。使用单链抗体作为抗原结合域的一个优点是，它们可以使用高通量技术如噬菌体和酵母展示文库从头产生，这是目前TCRs不能利用的特征。这一特性简化了开发分子所需的时间。与可溶性TCR类似，TCR mimic很小(~55 kDa)，使靶细胞和T细胞之间能够密切相互作用。TCR和TCR mimic的功能、结构和分子动力学比较表明，这两种抗原受体以不同的方式结合他们的靶标。这些差异部分归因于抗体的可变区与TCRs的不同取向。TCR通常结合p/HLA复合体的广泛区域，以肽的核心为中心，利用涉及多肽侧链和HLA分子不变区域的能量平衡的相互作用。相比之下，许多TCR mimic对接，偏向于HLA结合肽的极端末端或HLA螺旋之一，使用有限数量的高度聚焦的“热点”相互作用。在与高度交叉反应相关的常规TCR中已经观察到类似的结合模式。因此，与大多数TCR相比，TCR mimic似乎以一种允许更大程度的肽序列可变性的方式与p/HLA对接，这一特性可以导致交叉反应增加。通过筛选以肽为中心的方式结合的超罕见scFv或使用现有的与TCR-like拓扑对接的TCR mimic抗体作为突变的模板，可以克服这一限制。除了双特异性结合蛋白外，TCR mimic还可以被用于各种CAR设计。

基于TCR信号转导的设计

除了使用TCR作为肿瘤抗原结合域的策略外，还有几种新的治疗方法重新调整了TCR复合体的生理信号转导机制。这些基于TCR的替代方法可以提高受体的敏感性，同时潜在地减少与传统CAR设计相关的细胞因子相关毒性和T细胞耗竭。

T细胞抗原偶联器（TAC）

TAC是一种模块化的双特异性跨膜蛋白，在T细胞内以转基因的形式表达，并结合了两个结合域。一个结合域用于肿瘤抗原识别，第二个用于从内源性TCR复合体中招募信号成分(图1e)。与传统的CARs将T细胞激活、共刺激和抗原结合的区域整合到单个分子中不同，TAC缺乏内在的信号传递能力。在功能上，TAC修饰的T细胞在没有紧张性信号的情况下表现出抗原特异性细胞因子的产生和对靶细胞的杀伤活性，这是一些CAR设计的一个特征，导致加速T细胞耗尽。在体内，TAC修饰的T细胞显示出与传统的CAR修饰的T细胞相当的抗肿瘤效果，但没有细胞因子相关的毒性。

T细胞受体融合结构（TRuC）

TRuC是一种替代的抗原受体设计，类似于TAC，也与内源性TCR信号复合体结合。然而，与TAC不同的是，TAC使用非免疫原性(Gly4Ser)3接头将抗原结合的scFv共价连接到CD3ε分子的胞外区(图1f)。生化研究表明，多达两个TRuC分子被结合到TCR复合体中，这一发现与TCR复合体中CD3ε的天然化学计量比一致。与TAC修饰的T细胞相似，TRuC修饰的T细胞没有表现出紧张性信号，与CARs相比，它释放的细胞因子水平明显较低，同时保持了抗原特异性的细胞溶解能力。

合成TCR抗原受体/HLA非依赖的TCR（STAR/HIT）

合成TCR抗原受体(STAR)/HLA非依赖性TCR(HIT)是一种非HLA限制性受体，它用抗体的VH/VL结构域取代TCR的可变域(图1g)。由于TCR可变区与VH/VL结构域具有相似的大小和三重折叠，因此这些结构域可以互换替换。通过保留TCR恒定域，STAR/HIT受体重新招募CD3信号分子的完整复合体。与外源性TCR类似，STAR/HIT受体是一种异源二聚体，能够与内源性TCR半链错配。最小化错配可以使用与外源TCR相同的策略。在抗原刺激后，STAR/HIT受体诱导TCR-like信号，使对抗原位点密度较低的靶细胞的反应性增强。