【小优细节君】跨膜蛋白SLC怎么做？

转自：优宁维抗体专家

无细节，不实验

如果有人问WB样本制样最后一步是什么，大家肯定可以脱口而出，100℃煮样5min。确实，对于大部分蛋白来说这个步骤是没有问题的，而且是必须的，但是对于跨膜蛋白，情况就不一定了。

有研究发现，如果在检测转铁跨膜蛋白SLC时常规的加热变性，即使是最好的一抗也无法检测到目的蛋白，这是怎么回事呢？今天小优细节君就和大家一起来通过一篇研究一探究竟。

什么是SLC？

我们先了解下什么是SLC，SLC即Solute carriers，溶质载体，是一组膜转运蛋白，该家族蛋白包括400多个成员，大部分定位于细胞膜上，它们的主要功能是负责各类溶质的跨膜运输。作者在这篇研究中的对象主要是SLC11A2（DMT1）和SLC40A1（FPN1）这两个蛋白，他们的转运底物都是Fe2+。

话不多说，进入正题

首先作者在293细胞上过表达了Fpn1，但是在WB检测时发现蛋白并没有跑下来（在蓝色箭头所指位置），猜测应该是蛋白不溶解或者发生了聚集。

图1 Fpn1过表达检测

这里不得不提下全膜做WB的重要性，可以帮助我们了解更多的信息。如果只是裁膜做，就会发现目的区域没有条带，进而怀疑是试剂或者操作的问题，那就是另外一个story了。

溶解 or 聚集？

前面提到可能有两个原因，溶解或者聚集，接下来作者做了一个正交实验来排查问题。如果是溶解问题，使用三种不同的细胞裂解条件：RIPA裂解缓冲液(最常用的)、RIPA加超声处理（进阶）或者跨膜提取试剂；如果是聚集问题，使用加热或者不加热两种办法。

结果如下图，在左边加热（heating）的样本中，无论哪种裂解条件，转染的Fpn1基本都还在凝胶的顶部，没有看到目的条带。而右边不加热（no heating）的样本出现了Fpn1的条带，大概在63KD。可以初步得出结论，加热与否是影响Fpn1检测出条带的重要因素，比裂解条件更重要。

图2 加热与裂解条件对Fpn1蛋白检测的影响

为了进一步确认和排除其他因素，作者又使用了三种不同的上样缓冲液， 5%β-巯基乙醇(BME，最常用)，4M尿素，以及5%β-巯基乙醇+4M尿素。

结果如下图所示，当Fpn1蛋白被加热变性后时，无论哪种loading buffer都没有检测到目的条带。而未加热煮沸的样本，三种loading buffer都可以清楚检测到Fpn1。所以再次肯定了这个结论，Fpn1蛋白不加热是WB检测的最关键因素。

图3加热与loading buffer对Fpn1蛋白检测的影响

是否只有这个蛋白是这样的，不具有广泛性？

作者又做了另一个铁转运胞膜蛋白DMT1（SLC11A2），也设计了类似的实验来验证加热是否是最关键的影响因素。我们直接看结果图吧，加热过的样本几乎看不到DMT1的蛋白条带，而未加热的样本出现了75kDa的目的条带。

图4 加热与细胞组分对DMT1蛋白检测的影响

会不会加热只对外源转染的有影响，对内源表达的没影响或者有差异呢？

显然作者也想到了这一点。接下来，他对12个人源细胞系进行了加热和不加热的WB检测。结果显示，如果不加热样本，大多数细胞中（10/12）都可以检测到内源性DMT1的表达。而经过95˚C加热5分钟后，几乎都检测不到了，其中一些还是聚集在凝胶顶部。

图5 加热对不同细胞系内源DMT1蛋白检测的影响

Fpn1的结果有点意外，因为大部分细胞系加热和未加热之间没有明显差异，除了前面做的293转染的样本。后面作者又补充了几个实验，验证了这个条带确实是特异性的，包括siRNA和激活剂，抑制剂处理，但对于这个结果没有更好的解释，感兴趣的同学可以再深入研究一下。

图6 加热对不同细胞系内源Fpn1蛋白检测的影响

总结

以上这么多结果，足以给我们一些启发，对于SLC这类跨膜蛋白或者延伸到其他的膜蛋白，在WB检测不到目的蛋白或者条带太弱的情况下，我们可以尝试不加热样本，或者低温加热（50-70℃ 15min或者 37℃ 30min）来避免蛋白聚集在凝胶顶端。

有小伙伴问，为什么这么重要的信息，参考文献都不写清楚呢？这确实是个问题，小优细节君发现，目前的参考文献中对于WB步骤，都是标准化的步骤。也许其他蛋白标准化流程都可以做出来，而个别膜蛋白作者进行了优化而没有写明。

最后再辩证一下，整篇文章提到了膜蛋白不煮样的重要性，但是呢不是所有跨膜蛋白都要不加热制样，你可以看到文中做的内源性Fpn1就是不一样的结论。因此，小优细节君建议在做每一个新蛋白之前，一定要充分摸索样品制备的最佳条件，从而获得出色的结果。

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