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“我们提出了新的拉曼二象性的理论体系，为理解拉曼散射带来了新视角，它能帮助人们深入理解拉曼散射的物理本质，并为拉曼散射显微术的科研和应用带来指导。”对于自己的新论文，美国哥伦比亚大学闵玮教授表示。
拉曼显微术是目前在学术界和工业界被广泛使用的物质成像技术。而本次理论则能帮助人们更好地理解信号和处理信号，优化拉曼显微术的硬件实验条件和软件实验条件，也能为设计下一代拉曼显微术带来助力。
The Color of the Sea
一百多年前人们发现了拉曼散射，这是一种光与物质相互作用的基本形式。其中，部分散射光的频率会发生细微的改变。
同时，拉曼散射能够揭示物质内部的丰富结构。因此，自从这一现象被发现以来，已在化学分析、生物成像和产品表征中，扮演着不可替代的角色。
拉曼散射的发现，也是一个十分有趣的过程。1921 年，印度科学家 C.V. 拉曼（C.V. Raman）在横渡地中海时，被大海深邃的蓝色所吸引。
随后，他给 Nature 杂志写了一封信，信的标题叫《大海的颜色》（The Color of the Sea）。这封信指出：对于大海的蓝色来说，并不能利用太阳光在水中的弹性散射来解释。
同时，自此以后拉曼也迷上了光散射现象，并通过几年的潜心研究，于 1928 年发表了一篇著名论文《一种新型次级辐射》（A New Type of Secondary Radiation），论文中他首次报道了拉曼散射的实验现象。1930 年，拉曼获得诺贝尔物理学奖。
事实上，早在 1923 年奥地利物理学家阿道夫·斯梅卡尔（Adolf Smekal），就从理论上预测了非弹性光散射即拉曼散射的存在。
而自发的拉曼散射，在表观上是一个极其微弱的过程。因此，直到激光器的发明，拉曼散射才开始被用于纯物质的化学分析，并逐渐在化学学科中普及开来。
与此同时，受激拉曼散射（SRS，Stimulated Raman Scattering）的发现完全来自于一场偶然。受激拉曼散射，指的是当另一束与散射光频率相同的光，共同参与拉曼散射的时候，拉曼散射的速率会被大大提高。
1962 年，两名外国科学家无意间使用硝基苯作为 Q 开关的红宝石激光器，借此观察到激光波长的移动，随后发现了受激拉曼散射的现象。
从那以后，受激拉曼散射开始被用于制作拉曼激光器等，不过并未受到生物医学领域的广泛关注。
2008 年，这一局面终于被改变。当时，正在美国哈佛大学谢晓亮教授课题组做博士后的闵玮和研究生克里斯蒂安·弗洛伊迪格（Christian Freudiger），将这一现象与显微术相结合，发明了受激拉曼散射显微术。
受激拉曼散射显微术通过利用量子放大效应，让拉曼成像的速率得以几个数量级地大大提高。随后，受激拉曼散射逐渐被广泛用于无标记的生物成像、细胞和生物组织的代谢学和病理学研究中。
然而，尽管无标记成像技术成熟且易于使用，但是在化学特异性和生物选择性上都存在明显的不足。
图 | 首次利用受激拉曼散射实现无标记高灵敏细胞成像（来源：资料图）后来，完成博士后之后的闵玮，加入美国哥伦比亚大学任教。基于无标记的限制，他从化学生物学中获得启发，开发了一系列拉曼探针。
其中包括使用炔基、重水、氘代化合物等一系列小分子化合物，来提高受激拉曼散射的选择性和灵敏度。
利用这些小分子探针，他探究了糖、氨基酸、核苷酸、脂质等物质在细胞层面与动物层面的新陈代谢活动。
通过工程化设计的手段，他发明了基于共轭多炔的小分子染料 Carbow，借此将分子信号提高数十倍到数千倍。
为了增强信号强度，他还采用了另一种策略：将小分子物质打包成聚合物和纳米粒子。同时，他还将这一方法用于拉曼成像，进而用于免疫染色、纳米医学、微塑料检测等方面。
图 | 基于拉曼探针的受激拉曼散射显微术。a，b：基于炔基和氘代化合物的小分子代谢探针成像；c：基于 carbow 的超多色荧光拉曼复合成像；d：纳米粒子成像（来源：资料图）
同时，在提升受激拉曼散射的灵敏度上，闵玮也做出了贡献。
他曾将电子共振的概念引入受激拉曼散射，发明了电子预共振受激拉曼显微术，借此将拉曼染料的检测限降至 250nM（相当于 50 个分子）。
后来，通过调控分子结构、引入同位素等方法，他又开发出一套新型多色成像染料 MARS。
与传统荧光染料相比，MARS 的峰宽只有大约 1nm，故可被用于超多色生物成像。
随后，闵玮将组织透明化技术引入拉曼领域，在厚组织中实现了三维超多色立体成像，借此将生物成像的极限向前推进一大步。
为了进一步提高受激拉曼散射的灵敏度，他利用荧光和受激拉曼散射相结合的办法，发明了受激拉曼激发的荧光显微术，第一次在远场实现了单分子振动成像。
图 | 超高灵敏度的受激拉曼散射显微术。a：电子预共振受激拉曼显微术 MARS 染料多色成像；b：组织透明化超多色成像；c：受激拉曼激发荧光单分子成像（来源：资料图）
尽管受激拉曼显微术在诸多领域都得到应用，但是关于其基础理论的研究却一直停滞不前。
这一定程度上反映了拉曼领域的一个特点：即实验发明往往走在理论前面。
一直以来在该领域中，并没有系统性的理论来预测受激拉曼显微术的信号。此外，受激拉曼和自发拉曼谁更灵敏，一直尚未有定论。
从自发、到受激、再到单分子检测，回望十几年来拉曼技术的发展，拉曼似乎已经摆脱“极弱”的标签。但是，如果拉曼散射的确拥有如此之弱的过程，那么它又是如何做到单分子层面的成像呢？
针对这些问题，闵玮尝试利用传统的自发拉曼截面理论来进行解释，但由于该理论框架的内秉缺陷等问题，他曾尝试数次但都无功而返。
于是，他决定另辟蹊径：通过引入并建立一个新体系，最终得出了统一的答案。
“蹊径”
关于这条“蹊径”他是这么规划的：过去百年间的拉曼相关论文，都是使用拉曼散射截面（σRaman）来表征物质的拉曼散射强度。
但是，闵玮团队发现这个框架存在内秉缺陷，于是便想摒弃传统的 σRaman，而是以一种直接表观的方法，来表征物质在受激拉曼散射下的响应强度。
受激拉曼散射的速率、与入射的两束光的强度，都成正比关系，因此就得将这两个物理量引入公式。
那么，具体使用什么物理量来表征光强？双光子吸收，给闵玮等人带来了一定启发。于是，他们摒弃使用能量密度作为单位的传统做法，而是使用光子通量来作为单位。
这样定义出来的受激拉曼散射截面（σSRS）的单位便是 Goeppert-Mayer（GM），它和双光子吸收截面的单位互为一致。事实证明，这一选择非常正确，这让两个相同单位的物理量能够进行直接比较。
一开始，闵玮团队预计受激拉曼散射的截面会比双光子吸收小很多。之所以这条推理是因为：自发拉曼截面比线性吸收截面小了 8-14 个数量级。
但是，当他们把实验数据带入计算之后却发现：两者的大小几乎在同一数量级上。而对于电子共振条件下的分子来说，它的受激拉曼散射截面比双光子吸收截面高出许多。
这一发现可能是反直觉的、但却又是合理的，正因为受激拉曼散射的截面大，所以受激拉曼散射的灵敏度才可以被提至如此之高的程度。
那么，另一个问题则是：为什么自发拉曼如此之小？一开始，他们打算把两个拉曼截面（σRaman 和 σSRS）联系到一起来解释。即把自发拉曼看成是受激拉曼中的一种特例，而其中的一束光是由真空零点能的涨落提供的。这种做法在量子电动力学中也经常被提及。
通过公式推导，他们得出一个连接两个截面的公式，借此揭示了受激拉曼很强、而自发拉曼很弱的根本原因：即真空所贡献的微弱“虚光子”能量，决定了自发拉曼表观是一个低概率事件。
对于拉曼的这种独特性质，闵玮等人将其称之为“拉曼二象性”，并将前面的公式命名为拉曼二象性公式。
一定程度上，这两种拉曼过程可以进行相互转化：即受激拉曼是自发拉曼真空解耦的内核，而自发拉曼是受激拉曼在真空作用下的表观。
与常识相悖的是，真空并非一成不变的常数，而是可以被操控利用的。
图 | 自发拉曼散射可以看作是一种特殊的受激拉曼散射，其斯托克斯光子由真空零点能涨落提供。由于通常条件下真空提供的“有效功率”很低，所以自发拉曼表观上是一个非常弱的过程（来源：资料图）
值得一提的是，爱因斯坦早在 1917 年的关于激光的理论也同样连接了自发发射和受激辐射的过程，因此得到的爱因斯坦系数公式具有形式上的相似性。
通过进一步的推导，闵玮团队最终将自发发射、受激辐射、自发拉曼散射、受激拉曼散射四个过程统一在同一个公式下。从下图可见，这一公式展现出一种既对称又完备的美感。
图 | 绿框中展示的是爱因斯坦方程，蓝框中展示的是拉曼二象性方程。中间的对称公式首次成功将四种过程联系在一起（来源：资料图）
在相关论文的审稿过程中，他们意识到如果把前面得到的二象性方程代入回 σSRS 的定义式，就可以得到一个计算受激拉曼散射绝对信号的简易公式。
从这一公式出发，闵玮团队计算了多个化合物的理论受激拉曼散射信号和信噪比，并得到了令人满意的实验结果。
利用这一公式，他们还能计算脉冲激光每个光脉冲中间发生的受激拉曼散射事件数量，从而能够预测分子振动饱和的情况。
同时，这也让他们终于能够直接比较受激拉曼和自发拉曼二者的灵敏度。
在过去，比较上述两者的难点在于：受激拉曼散射的检测极限通常被散粒噪声所限制，而自发拉曼则没有，所以检测极限所使用的标准很难得到统一。
而在本次研究之中，他们尝试使用 SNR=1 来定义受激拉曼散射的检测极限。
对于自发拉曼的检测极限，则将其定义为只有一个散射光子产生的情况。
通过一系列推导和简化，该团队将所有变量打包成两个分别与激光和样品有关的变量，并使用画相图的方法，针对二者的灵敏度加以比较。这也意味着，从今以后无论实验条件如何，都可以在相图上读出检测极限。
图 | 拉曼检测相图，x 轴代表光子预算（包含激光能量、积分时间等因素），y 轴代表拉曼吸光度（包含样品浓度、分子截面等因素）。在同样的 x 条件下，y 越低代表灵敏度越高。从图中可以看出，在较低的光子预算条件下，受激拉曼散射会比自发拉曼更灵敏（来源：资料图）
总的来说，他们从定义新的受激拉曼截面，到深究其物理含义，再到推导出爱因斯坦系数的推广方程，最终发现了新的物理内涵。
而且可以肯定的是，拉曼二象性将能帮助人们更全面地认识拉曼散射的本质，也能帮助人们拓展受激拉曼散射显微术的应用场景。
图 | 拉曼散射的二象性（来源：资料图）闵玮是第一作者兼通讯作者，高新（Xin Gao）是第二作者。
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